Le tre vie di attivazione del complemento sono denominate via classica, via alternativa e via della lectina legante il mannano (Mannan Binding Lectin, MBL) (v. Fig. 146-4). Esse sono tutte dirette verso la più importante tra le singole tappe di attivazione, il clivaggio del C3. La via finale comune è denominata via terminale o complesso di attacco alla membrana (Membrane Attack Complex, MAC).

Nomenclatura: i componenti della via classica sono designati con una C seguita da un numero (p. es. C1, C3). A causa dell’ordine con il quale sono stati via via identificati, i primi quattro componenti sono numerati come C1, C4, C2 e C3. I componenti della via alternativa sono designati con una lettera (p. es. B, P, D). Alcuni componenti vengono denominati fattori (p. es. fattore B, fattore D). I componenti o i complessi attivati hanno una linea al di sopra del nome, che indica l’attivazione (p. es. C1, C1r, C3b,Bb). I frammenti di clivaggio sono designati con una lettera minuscola dopo il nome del componente da cui derivano (p. es. C3a e C3b sono frammenti del C3). Il C3b inattivo è designato come iC3b. Le catene polipeptidiche delle proteine del complemento sono designate con una lettera greca dopo il nome del componente (p. es. C3a e C3b sono le catene a e b del C3). I recettori della membrana cellulare per il C3 sono abbreviati come CR1, CR2, CR3 e CR4.

La via classica

Una volta che l’Ig si è legata al C1q, la molecola di quest’ultimo va incontro a una modificazione della sua struttura terziaria, causando l’attivazione autocatalitica del C1r in C1r. Il C1r scinde poi un legame all’interno del C1s per formare C1s. Quando vengono clivati il C1r o il C1s, non viene liberato alcun frammento di clivaggio.

Il C1s viene chiamato anche C1 esterasi. Esso può clivare il C4 in C4a e C4b. Se ciò avviene in presenza di una membrana il C4b, il frammento di clivaggio principale, vi si lega. Il C1s può quindi clivare il C2 libero per formare C2a e C2b, che è un processo scarsamente efficiente, oppure clivare il C2 contenuto in un complesso C4b,C2 per formare C4b,C2a e C2b libero, che è un processo ad alta efficienza. Il C2a è il frammento di clivaggio principale del C2. Se è stato clivato il C2 libero, il C2a deve legarsi al C4b per formare un complesso C4b,C2a, altrimenti il C2a si degraderà e diverrà inattivo. Il C4b, C2a è la C3 convertasi della via classica, la quale può clivare il C3 in C3a e C3b. Il sito enzimatico per il clivaggio del C3 è contenuto nel C2a. Il C4b, C2a richiede la presenza di magnesio e alle temperature fisiologiche si degrada spontaneamente nel tempo.

La via classica può essere attivata anche da meccanismi indipendenti dagli Ac. L’eparina (un anticoagulante polianionico) e la protamina (un policatione che viene utilizzato per neutralizzare l’eparina), quando sono presenti in concentrazioni equimolari, possono attivare la via classica. Si ritiene che diversi altri polianioni (p. es. il DNA e l’RNA) siano in grado di reagire direttamente con il C1q per attivare la via classica. La proteina C-reattiva ha la proprietà di provocare l’attivazione della via classica in assenza di Ac. Sono state anche descritte vie di attivazione che aggirano il C1, le quali non utilizzano i componenti della via classica ma portano ugualmente al clivaggio del C3. Una di esse è stata caratterizzata come la via della MBL.

Regolazione: la via classica viene regolata dall’inibitore della C1 esterasi (C1 esterase INHibitor, C1INH), il quale si lega stechiometricamente (1:1) al C1r e al C1s, come pure al C1r e al C1s, per inattivare in maniera stabile queste proteine. Il C1INH si lega stechiometricamente anche alla plasmina, alla callicreina, al fattore di Hageman attivato e al fattore XIa della coagulazione. La sua assenza è responsabile dell’edema angioneurotico ereditario (v. Cap. 148). Il fattore J è una glicoproteina cationica che inibisce anch’essa l’attività del C1. La proteina legante il C4 (C4 Binding Protein, C4BP) disassembla il complesso C4b,C2a, consentendo al fattore I di inattivare il C4b.

La via alternativa

Attivazione: la via alternativa (v. Fig. 146-6) viene attivata da sostanze presenti in natura (p. es. pareti cellulari dei lieviti, fattore del veleno di cobra, fattore nefritico, pareti cellulari batteriche [endotossine], GR di coniglio [in vitro]) e dalle IgA disposte in aggregati, rappresentando una forma di risposta immunitaria aspecifica (innata), cioè una risposta che non necessita di una precedente sensibilizzazione. La via alternativa non coinvolge il C1, il C4 e il C2, ma porta ugualmente al clivaggio del C3. Questa via è subordinata al clivaggio basale costante di piccole quantità di C3 in C3a e C3b. Questo clivaggio naturale del C3 è ancora scarsamente compreso e si pensa che avvenga attraverso un’azione enzimatica aspecifica sul C3 oppure grazie a un’attività a basso livello delle altre due vie di attivazione. Il C3b serve poi come substrato del fattore B per formare il complesso C3b,B. Il fattore D (un enzima attivato presente nel plasma) cliva il fattore B per formare C3b,Bb. La properdina (P) stabilizza questo complesso C3b,Bb per ritardarne la degradazione. Il C3b,Bb e il C3b,Bb,P sono le C3 convertasi della via alternativa, gli enzimi che clivano il C3 in C3a e C3b. Il sito enzimatico per il clivaggio del C3 è contenuto nel Bb. Il C3b,Bb richiede la presenza di magnesio e si degrada spontaneamente nel tempo.

La via alternativa è considerata come una via di amplificazione, dal momento che un unico complesso C3b,Bb può clivare molte molecole di C3. Tuttavia, l’amplificazione si verifica anche quando viene prodotto C1s e quando viene formato il C4b,C2a. Ognuno di questi enzimi può clivare centinaia di molecole, conducendo a una rapida attivazione del complemento.

Regolazione: il complesso C3b,Bb della via alternativa viene regolato da diversi fattori. La properdina ne ritarda la degradazione, prolungandone l’emivita da circa 4 min a 40 min. Le sostanze acceleratrici della degradazione (p. es. il fattore H o fattore di accelerazione della degradazione [Decay Accelerating Factor, DAF]) competono con il fattore B per il legame con il C3b (p. es. per formare C3b,H), accorciando l’emivita del complesso C3b,Bb e causando la sua dissociazione in C3b e Bb. Il fattore I agisce sul C3b,H per degradare il C3b (portando alla formazione di iC3b, C3c, C3d, C3f e C3dg).

L’attivazione o la non attivazione della via alternativa sono determinate dalle circostanze nelle quali il complesso C3b,Bb viene a formarsi. Le superfici alle quali il complesso C3b,Bb può aderire sono di due tipi: attivanti (p. es. pareti cellulari dei lieviti, GR di coniglio) oppure non attivanti (p. es. GR di pecora). Le superfici attivanti impediscono al fattore H di legarsi al C3b, mentre le superfici non attivanti consentono al fattore H di legarvisi e dissociare il C3b,Bb. Di conseguenza, il complesso C3b,Bb rimane attivo più a lungo su una superficie attivante che su una superficie non attivante.

Il meccanismo appena descritto spiega come la via alternativa venga attivata in vivo. Il fattore del veleno di cobra (Cobra Venom Factor, CoVF) è simile al C3b di cobra; il complesso CoVF,Bb è molto stabile e non è sensibile all’azione di degradazione del fattore H. Di conseguenza, il CoVF,Bb può condurre a un rapido e pressoché totale clivaggio del C3. Il fattore nefritico del C3 (C3 Nefphritic Factor, C3NeF) si trova nel siero del 10% circa dei pazienti con glomerulonefrite membranoproliferativa ed è una Ig diretta contro il complesso C3b,Bb. Il C3NeF agisce in maniera analoga alla properdina, tranne per il fatto che il complesso C3b,Bb,C3NeF è relativamente resistente all’azione di degradazione del fattore H. Le pareti dei lieviti (zymosan) e alcune membrane (p. es. i GR di coniglio) sono superfici attivanti sulle quali il complesso C3b,Bb è protetto dall’azione di degradazione del fattore H.

La via della lectina legante il mannano

La via della lectina legante il mannano (MBL) dipende per la sua attivazione dal riconoscimento innato di sostanze estranee (cioè, carboidrati). Questa via presenta analogie strutturali e funzionali con la via classica. La MBL è simile al C1q e la MASP-1 e la MASP-2 sembrano essere simili rispettivamente al C1r e al C1s della via classica. Pertanto, la MASP-2 potrebbe clivare il C4 e portare alla formazione di una C3 convertasi derivata dalla via della MBL.

Clivaggio del C3 e sue conseguenze

Le C3 convertasi clivano il C3 in C3a e C3b, processo che provoca la formazione all’interno del C3b di un sito di legame metastabile per le membrane. Se è disponibile una superficie o una membrana immediatamente dopo che il C3 ha subito l’azione della C3 convertasi, il C3b le si può legare in maniera covalente. Se non è disponibile una membrana o una superficie, il C3b diviene C3b in fase fluida e perde la capacità di legarsi covalentemente alle superfici cellulari. Il C3 può inoltre divenire simil-C3b se viene trattato con metilamina. Una volta che il C3b si è legato alla membrana tramite il sito di legame metastabile labile, esso può prendere parte alle attività biologiche legandosi a diversi recettori per il C3, può servire come efficace sito di legame per il fattore B per provocare un incremento del clivaggio del C3 attraverso la via alternativa, può partecipare alla formazione di una C5 convertasi, oppure subire l’azione del fattore I e di un cofattore per formare iC3b.

Quindi, il C3b può legarsi in modo covalente alle membrane mediante il suo sito di legame tiolestere metastabile e, una volta legatovisi, può interagire con diversi recettori a seconda della disponibilità di recettori per il C3 sulle cellule e dello stato di degradazione del C3 stesso. Il legame alle membrane mediante il sito di legame metastabile covalente non deve essere confuso con il legame non covalente che si stabilisce con i recettori.

Cellule T killer senza restrizione MHC

In aggiunta alle cellule NK CD3– TCR– CD56– , una diversa sottopopolazione è CD3⁺ CD56⁺ e può esprimere il CD2, il CD5 e il CD8. La maggior parte di tali elementi è TCR-gd, sebbene siano stati identificati alcuni cloni TCR-ab. Questa sottopopolazione può mediare una certa attività simil-NK spontanea e può incrementare tale attività dopo stimolazione con IL-2. Un’altra sottopopolazione di cellule T (CD3⁺ TCR-gd CD4– CD8– CD56– CD16–) può avere azione citotossica, sebbene nella maggior parte dei casi si tratti di cloni o linee cellulari. Rimane da chiarire se i linfociti isolati di recente che possiedono questo fenotipo siano dotati di attività citotossica spontanea.

Complesso di attacco alla membrana: la via terminale

La C3 convertasi (p. es. il C3b,Bb) può divenire C5 convertasi (p. es. C3b,Bb,C3b) attraverso l’aggiunta di un C3b al complesso (v. Fig. 146-7). La C5 convertasi cliva il C5 in C5a e C5b, dando inizio alla formazione del complesso di attacco alla membrana (MAC). Successivamente il C6 può legarsi al C5b per formare C5b,C6. In seguito, può legarvisi il C7 per formare C5b,C6,C7, il quale è in grado di legarsi alle membrane e ai doppi strati lipidici. Quando ciò si verifica su una cellula sulla cui superficie non è presente alcun prodotto del complemento oltre al complesso appena descritto, si parla di fenomeno dello spettatore innocente (il quale può portare all’emolisi della cellula incolpevole). Al complesso C5b,C6,C7 può quindi legarsi il C8 per formare C5b,C6,C7,C8, il quale è in grado di provocare una lisi cellulare lenta e poco efficace. In ultimo, al complesso si lega il C9 per dare luogo al C5b,C6,C7,C8,C9, che dà inizio alla lisi effettiva della cellula. Quando ulteriori molecole di C9 si aggiungono al complesso C5b-C9, la lisi si amplifica. Il MAC viene modulato dalla proteina S, chiamata anche vitronectina (la quale controlla l’attività del C5b-C7), dal fattore di restrizione omologo (Homologous Restriction Factor, HRF), dalla SP40,40 e dal CD59 (che regola l’attività del C8,C9).

Attività biologiche associate all’attivazione del complemento

La lisi cellulare è soltanto una delle molte attività biologiche associate all’attivazione del complemento e potrebbe non essere la più importante. In ambito clinico, la lisi si osserva nei pazienti affetti da emoglobinuria parossistica notturna, una rara malattia nella quale sono coinvolti deficit a carico del DAF (fattore accelerante la degradazione) delle proteine di membrana, del HRF (fattore di restrizione omologo) e del CD59.

I recettori per il complemento sono presenti su un gran numero di cellule diverse. Il CR1, la proteina cofattore di membrana (Membrane Cofactor Protein, MCP, CD46) e il DAF (CD55) regolano la degradazione del C3b. Il HRF e il CD59 impediscono la formazione del complesso di attacco alla membrana sulle cellule omologhe. Il CR1 (CD35) svolge inoltre un ruolo nella clearance degli immunocomplessi. Il CR2 (CD21) regola le funzioni delle cellule B (produzione di Ac) ed è il recettore per il virus di Epstein-Barr. Il CR3 (CD11b/CD18) interviene nella fagocitosi, mediando l’adesione delle particelle rivestite di iC3b destinate a essere fagocitate. Il CR4 è presente sulle piastrine ed è stato studiato meno bene degli altri recettori per il C3. La gp 150,95 svolge un ruolo nella migrazione dei monociti. I recettori per il C3a e il C4a legano rispettivamente il C3a e il C4a. Il recettore per il C5a lega il C5a e il C5a_desarg (C5a privo del residuo di arginina terminale) ed è presente su un’ampia varietà di cellule. Il recettore per il C1q lega la porzione collagena del C1q, consentendo il legame degli immunocomplessi ai fagociti.

Il C3a e il C5a hanno attività anafilotossinica, mentre il C4a si comporta come anafilotossina debole. Le anafilotossine causano aumento della permeabilità vascolare, contrazione della muscolatura liscia e degranulazione delle mast-cellule. Esse sono regolate dall’inattivatore delle anafilotossine (carbossipeptidasi N), il quale nel volgere di pochi secondi rimuove il residuo di arginina carbossiterminale.

La chemiotassi consiste nel richiamo di cellule all’interno di un’area infiammatoria. Il C5a possiede attività sia anafilotossinica sia chemiotattica, ma il C3a e il C4a non sono fattori chemiotattici. L’attività chemiotattica è stata descritta anche per l’iC5b-C7.

Il C5a e il C5a_desarg regolano le attività dei neutrofili e dei monociti. Il C5a può causare l’aumento dell’adesione cellulare, la degranulazione e il rilascio di enzimi intracellulari da parte dei granulociti, la produzione di radicali tossici dell’O₂ e l’avvio di altri eventi metabolici cellulari.

La clearance degli immunocomplessi è una funzione importante del complemento. La via classica può impedire la formazione di immunocomplessi di grandi dimensioni e la via alternativa può aumentare la solubilità degli immunocomplessi.

Le proteine complementari possono inoltre avere numerose altre attività biologiche. Alcuni frammenti del C3 (C3d o C3dg) possono contribuire alla regolazione della produzione di Ac attraverso il CR2 presente sulle cellule. L’edema angioneurotico ereditario, il quale è causato da un deficit di C1-inibitore, potrebbe essere mediato da una sostanza chinino-simile ancora poco definita. Un frammento poco caratterizzato del C3 (C3e, fattore di mobilizzazione dei leucociti) può provocare la mobilizzazione dei GB dal midollo osseo. Il frammento Bb del fattore B aumenta la diffusione e l’adesività dei macrofagi. L’attivazione del complemento può inoltre neutralizzare i virus e indurre leucocitosi.

Metodi di valutazione dell’attività funzionale del complemento